Разработка альтернативного формата фрагмента антитела, который можно производить в цитоплазме Escherichia coli.

Научные отчеты, том 13, Номер статьи: 14188 (2023) Цитировать эту статью

Подробности о метриках

Благодаря повышенной доступности и проникновению в ткани более мелкие форматы антител, такие как фрагменты антител (Fab) и одноцепочечные вариабельные фрагменты (scFv), демонстрируют потенциал в качестве эффективного и недорогого выбора по сравнению с полноразмерными антителами. Эти форматы, основанные на модульной архитектуре антител, могут изменить ситуацию в некоторых терапевтических и диагностических приложениях. Микробные хозяева показали огромные перспективы в качестве хозяев-продуцентов форматов фрагментов антител. Однако низкие выходы целевого белка в сочетании со сложностью сворачивания белка приводят к ограничениям производства. Здесь мы сообщаем об альтернативном формате фрагмента антитела «FabH3», разработанном для преодоления некоторых ключевых узких мест, связанных со сворачиванием и производством Fab. Молекула FabH3 основана на формате Fab, в котором константные домены заменены сконструированными доменами CH3 иммуноглобулина G1 (IgG1), способными к гетеродимеризации на основе подхода электростатического управления. Мы показываем, что этот альтернативный формат фрагмента антитела может быть эффективно получен в цитоплазме E. coli с использованием катализируемой системы образования дисульфидных связей (CyDisCo) в нативном свернутом состоянии с более высокими выходами растворимости, чем у его Fab-аналога, и сопоставимой аффинностью связывания с целевой антиген.

Среди биотерапевтических препаратов сегмент моноклональных антител (Mab) занимает доминирующее положение на рынке, однако эта тенденция, похоже, постепенно меняется с развитием новых форматов антител и новых лекарств1. Полноразмерные моноклональные антитела имеют длительный период полувыведения из циркуляции, что может сделать их непригодными для определенных терапевтических и диагностических применений2. В качестве потенциального решения фрагменты антител (Fab) стали ключевыми игроками в биофармацевтической промышленности. Они предлагают определенные преимущества, такие как улучшенное и глубокое проникновение в опухоль, связывание со специфическими эпитопами, недоступными для Mab, связывание моновалентного антигена с потенциально сниженной иммуногенностью, более высокая стабильность, чем у меньших форматов фрагментов антител, и более быстрый клиренс3,4,5. Многочисленные применения молекул на основе антител в качестве терапевтических и диагностических средств увеличили спрос на них, а затем и потребность в их производстве с высокими выходами.

Многие одобренные биоподобные продукты и продукты типа «я тоже» были произведены с использованием микробных систем экспрессии, для которых E. coli остается предпочтительным хозяином6. Поскольку фрагменты антител Fab и scFv негликозилированы и относительно малы, их производство в E. coli может быть более простым и экономически выгодным, чем в традиционных системах культивирования клеток млекопитающих. Фрагменты антител представляют собой белки с дисульфидными связями, которые традиционно рекомбинантно продуцируются в окислительной периплазме или в виде телец включения в восстанавливающей цитоплазме E. coli. Однако оба подхода создают критические узкие места в эффективном производстве этих представляющих интерес белков. Периплазматическая экспрессия Fab часто приводит к низким выходам белка, главным образом из-за неэффективной транслокации белков и небольшого объема периплазмы, в то время как цитоплазматическая экспрессия сталкивается с ограничениями с точки зрения деградации белков в ненативном состоянии и агрегации с тельцами включения. Из семи продаваемых Fab два производятся в E. coli в форме телец включения3,7. Складывание Fab представляет собой сложный процесс, включающий образование дисульфидных связей, цис-транс-пролильную изомеризацию и контролируемую олигомеризацию, и, следовательно, рефолдинг телец включений часто неэффективен и дорог8.

Fab-фрагменты состоят из двух ковалентно связанных полипептидных цепей, а именно тяжелой (HC) и легкой (LC) цепей, которые содержат соответственно два константных домена CH1 и CL и два антигенсвязывающих вариабельных домена VH и VL (рис. 1А). Домен CH1 изолированно представляет собой неупорядоченный белок и остается в развернутом состоянии независимо от образования дисульфидных связей9. Одним из критических этапов, ограничивающих скорость сворачивания фрагментов антител, является ассоциация константных доменов, поскольку домен CH1 принимает типичную складку иммуноглобулина (Ig) только при взаимодействии с доменом CL9,10. Кроме того, низкая стабильность HC в сочетании с образованием ковалентно и нековалентно связанных димеров LC гарантирует необходимость балансирования синтеза двух цепей11,12. Разработка и скрининг конструкций с различной силой трансляции LC и HC для оптимальной экспрессии Fab может быть трудоемким, дорогим и не обязательно может привести к успеху. Существует несколько подходов к обеспечению эффективной гетеродимеризации в молекуле Fab, например, Ojima-Kato et al. сообщили о слиянии пар пептидов лейцин-молния с константными доменами (Zipbody)13. Однако это ограничивает терапевтическое применение Fab из-за необходимости этапов расщепления метки и последующих проблем с иммуногенностью.